소개
앞선 글에서 PCR이 사용되는 분야와 작동원리, PCR의 종류에 대해 간단히 설명드렸습니다.
이 기사에서는 PCR 사용하는 시약과 효소의 종류와 역할에 대해 알아보자
1) PCR 시약 구성: 효소
(1) DNA 중합효소(DNA polymerase)
: Primer가 첨가된 dNTP 사용 확장 단계를 수행하는 역할하다. 몇 가지 유형의 중합효소가 사용되지만 가장 일반적으로 사용되는 유형에는 Taq 및 Pfu DNA 중합효소가 포함됩니다.있습니다.
• Taq DNA polymerase: 고온 환경의 온천에 서식하는 내열성 세균(Thermus aquaticus)에서 유래한 효소입니다. 열에 안정하여 PCR에 많이 사용됩니다. 그러나 복제 과정에서 필요한 교정 기능이 부족합니다. 정확성보다 효율성이 중요한 PCR 작업에 사용되어가고 있습니다.
• Pfu DNA 중합효소: 마찬가지로 고온에서 자라는 박테리아(pyrococus furiosus)에서 분리한 효소입니다. 3`-5` exonuclease 기능을 통한 보정 기능대표하다, 정확도가 중요한 PCR 연구에 사용하고있다
2) 역전사(reverse transcriptase)
: RNA template를 기반으로 공급되는 dNTP를 이용하여 역전사를 통해 상보적인 DNA(cDNA)를 합성하는 역할을 합니다. 합성된 cDNA를 이용하여 PCR을 수행한다.
: 역전사효소의 종류 조류 골수모세포증 바이러스(AMV) 역전사효소 그리고 몰로니 쥐 백혈병 바이러스(M-MulLV, MMLV) 역전사 효소가 주로 사용됩니다. AMV 역전사 효소는 RNase H를 활성화합니다MMLV는 상대적 부재를 특징으로 합니다.
- 기질로 사용되는 RNA는 역전사 후 합성된 cDNA에 부착된 상태로 남아 있을 수 있습니다. 이러한 cDNA를 PCR 반응에 사용하는 경우 annealing 단계에서 프라이머가 부착된 RNA에 결합할 수 없습니다. RNase H가 없으면 PCR 효율이 감소할 수 있습니다.
- RNase H는 cDNA에 부착된 RNA를 제거하는 역할을 하며, 과도한 효소 활성은 역전사 동안 cDNA 합성을 방해합니다.될 수 있다
2) PCR 시약 조성: 기타 기질
(1) DNA 결합 염료
: 기존의 gel loading을 통해 분리하여 Etbr 염색을 형광으로 확인하는 방법에 있어서, DNA에 직접 결합하는 형광 염료를 이용한 실시간 PCR 측정법 도입(real time-PCR)당신은 할 수 있습니다. 사용되는 DNA 결합 염료는 주로 Sybergreen과 Taqman두 가지 물질이 있다 PCR에 의한 합성산물이 증가할수록 증가하는 형광을 측정하는 원리로 사용됩니다
– 사이버그린
: SYBR Green은 double-stranded DNA에 결합하여 형광을 발하는 블리스터입니다. SYBR은 대부분의 이중 가닥 DNA에 잘 결합합니다.이것은 프라이머를 설계할 때 형광 리포터 시스템을 포함하거나 형광 라벨링을 고려할 필요가 없습니다. ~하도록 하다 다양한 활용성을 가지고 있어 가장 널리 사용되고 있습니다. 그러나 반대로 입문서에 의해 비특이적으로 발생하는 수반물에 대한 결합의 단점있다
– 태크맨
: TaqMan은 Taq DNA polymerase의 기능입니다. 5′-3′ 엑소뉴클레아제에 의해 활성화되는 메커니즘TaqMan은 5’말단에 형광단과 3’말단에 형광을 흡수하는 quencher가 있는 프로브로 annealing 단계에서 프로브가 DNA template에 부착됩니다. 이후 Taq DNA polymerase가 작용하면 부착된 probe는 5′-3′ exonuclease에 의해 분리되는데 이때 형광과 quencher가 떨어지며 quencher가 흡수한 형광에너지를 방출하여 형광을 증가시킨다.나타냅니다. 이러한 특징 때문에 TaqMan을 이용하여 PCR을 수행할 경우 일반적으로 5′-3′ exonuclease 활성의 Tm보다 낮은 온도에서 elongation이 이루어지므로 Tm보다 8~10℃ 높은 온도에서 binding이 이루어지게 된다. 프라이머의. 하도록 설계되었습니다.
(2) dNTP
: 네 종류 DNA 합성에 필요한 기질(dATP, dCTP, dGTP, dTTP: 각각 아데노신, 시토신, 구아닌, 티민을 포함하는 시약입니다. 역전사효소는 상보적인 기질을 RNA 주형에 부착하여 cDNA를 합성합니다.
(3) 염화마그네슘
: 보조인자로 효소의 기능을 향상시키는 역할을 합니다. Mg+는 DNA 중합 효소의 효소 기능을 증가시켜 증폭 속도를 높입니다. dNTP에 부착하여 베타인산과 감마인산을 쉽게 제거할 수 있어 주형에서 합성이 용이합니다.그것은 많은 도움이
결승선
이상으로 PCR에 사용되는 시약에 대해 알아보았습니다. 내용을 알고 실험해보면 어떤 점을 주의해야 하는지 알 수 있을 것입니다. 이 여분의 긴 게시물을 읽어 주셔서 감사합니다.